服務介紹：

　　原位雜交原理：原位雜交是指將特定標記的已知序列核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。

原位雜交實驗步驟：

1. 脫蠟至水

依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-二甲苯Ⅲ15 min-無水乙醇10 min-90%酒精10 min-80%酒精10 min -70%酒精10 min -純水沖洗。

2. 酶修復

細胞樣本：等待切片完全干燥后，用組畫筆（推薦HKR14P原位雜交專用組畫筆）畫出大小合適的疏水圈，在原位雜交儀中或濕盒中水平放置切片。將100ul蛋白酶K修復液(1X)滴于組織上，37℃孵育10min，純水沖洗終止反應。

冰凍切片：細胞樣本：等待切片完全干燥后，用組畫筆（推薦HKR14P原位雜交專用組畫筆）畫出大小合適的疏水圈，在原位雜交儀中或濕盒中水平放置切片。將100ul蛋白酶K修復液(1X)滴于組織上，37℃孵育20min（冰凍切片），純水沖洗終止反應。

石蠟切片：將裝入玻片的玻片架放入修復槽，倒入1x檸檬酸6.0修復液（樣本區(qū)域須被浸沒），蓋上蓋子，用膠帶紙封住，放入微波爐中，中火8min，停8min，中低火8min。自然冷卻降溫后，用3%雙氧水封閉15min。

3. 封閉

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul封閉液，37℃孵育30min，洗滌1次，每次5min。洗滌步驟：將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（樣本區(qū)域須被浸沒），置于搖床上5min，轉速為60。

4. 探針雜交

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的探針，37℃孵育3h或過夜，注意保持濕度以防干片。洗滌5次，每次5min。洗滌步驟：將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（樣本區(qū)域須被浸沒），置于搖床上5min，轉速為60。

5. 探針放大

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的放大探針，37℃孵育1.5h，注意保持濕度以防干片。洗滌5次，每次5min。洗滌步驟：將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（樣本區(qū)域須被浸沒），置于搖床上5min，轉速為60。

6. HRP-鼠抗地高辛

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的HRP-鼠抗地高辛（1x），37℃濕盒孵育40min；洗滌5次，每次5min。洗滌步驟：將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入洗液（樣本區(qū)域須被浸沒），置于搖床上5min，轉速為60。

7. 顯色

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的TSA顯色液，室溫孵育10min。純水沖洗，終止反應。

8. 抗體洗脫

將裝入玻片的玻片架放入洗液缸，倒入抗體洗脫液（樣本區(qū)域須被浸沒），室溫孵育10min，純水洗5次，每次5min。

9. 加一抗

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul按1:200稀釋的抗體工作液，4℃孵育過夜。PBS緩沖液洗滌5次，每次5min。

10. 加二抗

甩干切片上的液體，每張切片滴加即用型POLY-HRP羊抗兔鼠通用二抗，室溫孵育1h。PBS緩沖液洗滌5次，每次5min。

11. 顯色

甩干切片上的液體，每張切片滴加100ul的TSA顯色液，室溫孵育10min。純水沖洗，終止反應。

12. DAPI染核

每張切片滴加50ul DAPI染液，避光孵育10min，純水沖洗后滴加封片劑封片。