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石蠟切片免疫熒光實驗報告

一、實驗器材及試劑

1. 實驗器材

• 主要實驗試劑

• 石蠟切片免疫熒光實驗步驟
• 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ12min-二甲苯Ⅱ12min-無水乙醇Ⅰ6min -95%酒精6min-85%酒精6min蒸餾水洗。
• 抗原修復：組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復液（PH6.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，中火8min?；?min中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
• 阻斷內源性過氧化物酶：切片加上3%的雙氧水，室溫孵育25min，將玻片置PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
• 血清封閉:在組化圈內滴加3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
• 加一抗：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加按一定比例稀的抗體覆蓋組織。切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。
• 信號放大:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min 。滴加相對應顏色Flare信號放大試劑，3-5min.將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min 。雙標或者多標的實驗從這一步結束后重復步驟2-7，標記第二個、或者第三個抗體，最后在進入步驟8即可。

8、DAPI復染細胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。