杭州浩克生物一、項目介紹
EMSA 是一種用于研究核酸和蛋白質之間相互作用的技 術，適用于轉錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗，主要是 驗證蛋白質與特定核酸序列的結合特性，從而間接推斷已知蛋 白質的靶序列或已知序列的結合蛋白質分子。
二、實驗步驟
1、 蛋白的提取
漿蛋白核蛋白提?。毎说鞍着c細胞漿蛋白抽提試劑盒）
1.1 準備溶液：室溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A備用，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。取適當量的細胞核蛋白抽提試劑備用，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
1.2 對于貼壁細胞：用PBS洗一遍，用細胞刮子刮下細胞，或用EDTA溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
1.3 對于懸浮細胞：用PBS洗一遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。
1.4 對于新鮮組織：
1.4.1 把組織盡可能切成非常細小的碎片。按照20:1的比例混合適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A和B(例如200微升細胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至最終濃度為1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃勻漿器內充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進行。
1.4.2 勻漿后把勻漿液轉移到塑料離心管內，冰浴放置15分鐘。
1.4.3 4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉移至一預冷的塑料管中，為抽提得到的部分細胞漿蛋白。(吸上清時千萬不要觸及沉淀。)
1.4.4 對于沉淀，到了這一步已經充分勻漿，但很多細胞還沒有破碎。
1.4.5 每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。(對于二百萬Hela細胞，其細胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)
1.4.6 最高速劇烈Vortex 5秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開。(如果細胞沉淀沒有完全懸浮并分散開，可以適當延長vortex時間。)
1.4.7 冰浴10-15分鐘。
1.4.8 加入細胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。最高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。
1.4.9 最高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。
1.4.10 立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以凍存。(千萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。)
1.4.11 對于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會帶來細胞漿蛋白的污染。)
1.4.12 最高速劇烈Vortex 15-30秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。
1.4.13 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。
1.5 每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。(對于二百萬Hela細胞，其細胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)
1.6 最高速劇烈Vortex 5秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開。(如果細胞沉淀沒有完全懸浮并分散開，可以適當延長vortex時間。)
1.7 冰浴10-15分鐘。
1.8 加入細胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。最高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。
1.9 最高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。
1.10 立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以凍存。(千萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。)
1.11 對于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會帶來細胞漿蛋白的污染。)
1.12 最高速劇烈Vortex 15-30秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。
1.13 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。
1.14 立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞核蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以-70℃凍存。
2、 制膠 （1.5mm膠，大約30分鐘膠會凝）
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試劑 |
濃度5.5％ |
|
H2O ml |
7.50 |
|
10*TBE ul |
500 |
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40％丙烯酰胺 ml |
1.50 |
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50%甘油 ul |
500 |
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10％AP ul |
50 |
|
TEMED ul |
10 |
|
總體積 ml |
10 |
待膠完全凝固后120v預電泳1h，緩沖液用預冷的0.5×TBE。
3、 蛋白與探針反應(注：蛋白濃度1 ug/uL ,上樣體積2 uL)
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試劑名稱 |
陰性對照 |
樣品組 |
冷競爭 |
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10×binding buffer |
2 |
2 |
2 |
|
1ug/ul poly（dl.dc） |
1 |
1 |
1 |
|
50％glycerol |
1 |
1 |
1 |
|
1%NP-40 |
1 |
1 |
1 |
|
100m M Mgcl |
1 |
1 |
1 |
|
200m M EDTA |
1 |
1 |
1 |
|
Protein |
– |
+ |
+ |
|
標記探針（200 fmol） |
+ |
+ |
+ |
|
未標記探針(40 pmol) |
0 |
0 |
+ |
|
H2O |
+ |
+ |
+ |
|
總體積 |
20 |
20 |
20 |
混合后室溫放置20分鐘。
4、 上樣
預電泳完后馬上更換預冷的電泳緩沖液，加5ul的5×上樣緩沖液到樣品混合液中，馬上上樣電泳。180v ，60min。
5、 電轉移
將帶正電的尼龍膜放入0.5×TBE中平衡10分鐘。待電泳完成后將加有樣品的整塊膠取下電轉。轉膜緩沖液為預冷的0.5×TBE。300m A 30分鐘。
6、 交聯(lián)
轉膜完成后將膜取出，放在一張干凈的濾紙上，做好標記。于紫外燈下20cm處作用20分鐘。
7、 封閉
將交聯(lián)完成的尼龍膜取出放入洗凈的孵育槽，用封閉液封閉20分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。(慢搖)。
8、 抗體反應
倒掉封閉液。用封閉液將抗體稀釋300倍后，與膜完全作用30分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。(慢搖).
9、 洗脫
用1×的洗脫液清洗3次,每次5分鐘。搖床速度加大。
10、平衡
用平衡液平衡5分鐘。
11、ECL發(fā)光檢測
12、圖像分析（灰度比分析結果見EXCEl表格）
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