杭州浩克生物按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，不同指標(biāo)操作不一樣。具體以訂購(gòu)的試劑盒說(shuō)明書為準(zhǔn)。基本步驟如下：
1.包被：用碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10μg/ml。在聚苯乙烯酶標(biāo)板的每孔加100μl，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。(一般商品化的試劑盒中已包被好抗體，此步驟可省略)
2.封閉：每孔加入200ul封閉液，37℃或室溫孵育1-2 h。
3.洗滌：小心揭掉封板膜，放入洗板機(jī)，洗滌3-5遍。也可以手動(dòng)洗板：棄去液體，每孔加入300ul洗液，浸泡1-2min，在吸水紙上拍干，重復(fù)3-5遍。(一般商品化的試劑盒中已包被好抗體，前三個(gè)步驟可省略)
4.加樣：加適當(dāng)稀釋的待檢樣品100μl于上述已包被的反應(yīng)孔中。(同時(shí)做空白孔，倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品孔，有條件可加做陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔作為質(zhì)控點(diǎn))。
5.溫育：用封板膜封板后置37℃孵育1-2 h。
6.洗滌：同步驟3。
7.加抗體：于各孔中加稀釋好的生物素化抗體工作液100 μl。
8.溫育：用封板膜封板后置37℃孵育1 h。
9.洗滌：同步驟3。
10.加酶結(jié)合物：于各孔中加稀釋好的酶結(jié)合物工作液100 μl。
11.溫育：用封板膜封板后置37℃避光孵育30 min。
12.洗滌：同步驟3。
13.加顯色底物：于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37℃避光反應(yīng)10～30min，直到倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯的顏色梯度為止。
14.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸100 μl，顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。
15.結(jié)果測(cè)定：10min內(nèi)，在酶標(biāo)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值。
二、ELISA結(jié)果計(jì)算
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣本濃度。
三、注意事項(xiàng)
1、樣本要求：樣本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除;避免使用溶血、高血脂樣本。樣本收集后若不立即檢測(cè)，凍存于-80°冰箱，避免反復(fù)凍融。樣本每次檢測(cè)使用前要混勻，用完后將相應(yīng)版布局及樣本編號(hào)記錄在實(shí)驗(yàn)本上，樣本及時(shí)放入冰箱。
2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1.對(duì)應(yīng)訂單找到相應(yīng)的樣本和試劑盒。
2.核對(duì)樣本個(gè)數(shù)、種類、編號(hào)、樣本量是否足夠，核對(duì)試劑盒種屬、個(gè)數(shù)、日期，確定試劑盒是否夠用、有沒(méi)有過(guò)期。
3.注意訂單上備注欄客戶的要求，是否做復(fù)孔等。(以上三點(diǎn)有問(wèn)題在實(shí)驗(yàn)前及時(shí)與銷售溝通)
注：安排好時(shí)間，注意實(shí)驗(yàn)節(jié)奏，做好相應(yīng)的記錄幫助記憶，安排要有條理。
3、操作要求
1.試劑盒在使用前要平衡到室溫，底物在使用前應(yīng)保存在暗處，避光;
2.正式實(shí)驗(yàn)前需做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的稀釋倍數(shù)，做預(yù)實(shí)驗(yàn)前注意說(shuō)明書上建議稀釋倍數(shù)。預(yù)實(shí)驗(yàn)雙抗夾心法選取標(biāo)曲最高兩個(gè)點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)法選取標(biāo)曲最高點(diǎn)與最低點(diǎn)，選取兩個(gè)樣本根據(jù)建議稀釋倍數(shù)稀釋三個(gè)梯度;
3.孵育溫度與時(shí)間準(zhǔn)確;洗板非常重要，每步洗板都一定要洗干凈;
4.標(biāo)準(zhǔn)品在用前稀釋，且稀釋的每一步都要混勻，注意標(biāo)曲的起始濃度是否與重溶濃度一致;
5.點(diǎn)樣量一定要精確，完全打盡移液槍內(nèi)樣本與試劑，快速、等量的將試劑分配到各個(gè)微孔中;
6.抗體和HRP稀釋倍數(shù)要嚴(yán)格按照說(shuō)明書規(guī)定稀釋;
7.各步驟之間，需用封板貼密封反應(yīng)板避免蒸發(fā);實(shí)驗(yàn)一旦開始，應(yīng)連續(xù)完成所有的實(shí)驗(yàn)步驟，切勿中斷。
4、常用各個(gè)廠家試劑盒操作不同及需注意的地方
欣博盛：抗體和HRP都是30倍稀釋，且實(shí)驗(yàn)中每步都要洗板5次
eBiosience(備貨需包板)：包被液用前需稀釋10倍，稀釋液用之前要稀釋5倍，包被抗體檢測(cè)抗體以及HRP都是250倍稀釋。用前要提前算好所需試劑量，包被4度過(guò)夜，反應(yīng)溫度為室溫。
聯(lián)科/eBiosience(商品已包被)：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與樣本稀釋液不是通用稀釋液;檢測(cè)緩沖液用之前要稀釋;加樣前需要洗板，在板干之前加樣且標(biāo)準(zhǔn)品樣本和抗體連續(xù)加入，操作不要中斷，反應(yīng)溫度為室溫?fù)u床。
優(yōu)爾生/華美：加樣孵育后加抗體之前不需要洗板，加完抗體孵育后加HRP之前洗板3次，加完HRP孵育后顯色前洗板5次。華美試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與樣本稀釋液為通用稀釋液，優(yōu)爾生沒(méi)有樣本稀釋液，一般用PBS稀釋。
注：以上均為常見的試劑盒廠家，進(jìn)口試劑盒及競(jìng)爭(zhēng)法試劑盒仔細(xì)核對(duì)說(shuō)明書后操作。
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